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摘自《中國沼氣》第6期 趙宇莎 鄭丹 于琪 茍敬 湯岳琴

沼氣工程沼氣池厭氧消化能有效地促進能源與環境的協調發  展,一直備受關注。該過程通常需要不同微生物群  落(發酵細菌,產氫產乙酸菌和產甲烷菌)的參與協  作,才能實現甲烷的生產。研究證實,有更多功  能與特性未知的未培養微生物參與了沼氣工程沼氣池厭氧消化過  程,產甲烷機制比預期的更加復雜2。因此,鑒定  沼氣工程沼氣池厭氧消化體系中的微生物多樣性,有助于深入理解  產甲烷機制并指導工藝優化調控。宏基因組學是近  20年新興的科學領域,它避開微生物的分離培養過

程,直接從基因層面原位研究微生物的多樣性,可最大限度地識別環境微生物的群落信息?；诤昊蚪M的分子生物學技術(如DGGE,16sRNA基因克隆文庫,T-RFLP等)的發展,已經成為分析沼氣工程沼氣池厭氧消化過程優勢微生物的重要平臺。但這些傳統方法鑒定到的優勢菌群往往并非是“真正”的功能微生物。

DNA穩定同位素探針( DNA stable- Isotope pro-bing,DNA-SP)是一種新興的分子生態學技術,可

用于甄別復雜環境中參與特殊代謝功能的微生物。  其基本原理為:環境樣品經穩定同位素標記的底物  (以C為主)培養后,微生物利用“C底物生長繁殖  合成"CDNA,通過浮力密度差異將”CDNA與”C  DNA分離,進一步對CDNA進行分析即可獲得功  能微生物的信息。由于 DNA-SIP僅以來源于底物  利用菌的CDNA為研究對象,因此極大地降低了  環境微生物群落的復雜性,從而將底物代謝過程與  微生物群落組成直接相聯系3。鑒于 DNA-SIH技  術的優勢,現已被應用于不同環境中各類微生物功  能菌的鑒定(如甲基互營,生物降解,碳氮循環等過  程),但其在沼氣工程沼氣池厭氧消化過程中的應用相對較少6  此外, DNA-SIP存在CDNA回收量小、時間

長、容易交叉標記等缺陷,因此,探索合適的標記及  離心條件并獲得足夠的CDNA是成功富集功能微

生物的關鍵。本研究以”C葡萄糖為底物,考察

了不同條件對沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的標記  效果旨在為鑒定真正的沼氣工程沼氣池厭氧消化功能群提供基礎,

進而促進對沼氣工程沼氣池厭氧產甲烷機制的理解。

材料與方法

1.I污泥來源

用于穩定同位素標記的污泥來自本實驗的纖維

素沼氣工程沼氣池厭氧消化反應器。該完全混合型反應器總體積3L

工作體積2L,纖維素進料負荷為1gLd-1,在53℃

低速攪拌(85mm)條件下連續穩定運行212d。

1.2試劑

主要試劑如”C葡萄糖(C,99%),CsCl,CTAB購于 sIgma公司(美國)

1.3污泥樣品的標記及分析

1.3.1標記樣品的培養及采樣

取30mL沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥于50mL沼氣工程沼氣池厭氧瓶中,通

氮氣置換空氣后,立即采用丁基膠塞和鋁蓋密封并放置于搖床中餓養至污泥停止產氣。隨后將葡萄糖溶于滅菌水后采用無菌注射器投入沼氣工程沼氣池厭氧瓶,同時補充少量微量元素溶液,于53℃和150mpm條件下培養并取樣分析。底物添加及取樣操作均在沼氣工程沼氣池厭氧手套箱( Gene Science AG30,美國)中進行。所有處理均設置兩個平行樣,并分別以C葡萄糖作為對照。其中,使用的微量元素溶液組分如下(gL)FeCl3·6H2O,1.35;MnCl2·4H2O,0.1;CaC2·2H,0,0.1;ZnC2,0.1;CuO2H20,0.025;H3BO3,0  01;Na2MO4·2H20,0.024;NaCl,1.O;Na2SeO3·5

H2O,0.026;次氮基三乙酸(NTA),12.8  1.3.2標記過程的氣體和樣品收集

定期采用10mL無菌注射器測定產氣量  品樣定期取樣后,于12000pm,4℃離心10min后

污泥沉淀和適量體積PBS緩沖溶液混合震蕩,于

12000m,4℃離心10min,反復清洗2-3次后,去除上清液,污泥沉淀保存于-80℃,用于后續的PCR1.3.3超高速密度梯度離心分離

利用常規CTAB法提取污泥的總DNA。取

Hg DNA,與4.8 mL CsCl溶液,1.2 mL Grader

er(GB緩沖液)混勻,采用10m無菌注射器將混合液移至6ml超高速離心管中,于超高速離心機( Beckman Coulter, OptimaI.80XP,美國)離心形成浮力密度梯度區帶。離心后使用軟管連接精密注射泵( Harvard Apparatus Pump Il Pico Plus,美國)與離心管,利用無菌水的水壓收集各層樣品,并采用折光儀( Reichert AR200,美國)測定各層級折光率。折光率與密度的換算公式如下:

n=0.07969+1.2649

式中:n為液體折光率;p為液體密度,gmL

1.3.4熒光定量PCR分析

對各層樣品的16 SrNA基因含量(拷貝數)進行熒光定量PCR分析。反應體系總體積為20μl包括:10uM引物Eu518F及Eu27F各0.8ul,SYBR染液10山1,DNA2.0,滅菌水6.4ul。PCR反應  條件如下:95℃,預變性308;95℃,變性10s,50℃退火5s,72℃,延伸40s,共40個循環;融解95℃10s,65℃60s,97℃1s;冷卻37℃30s。以16sTDNA基因的豐度(每層拷貝數與各層級拷貝數總和的比值)為縱坐標,浮力密度為橫坐標,可得16mDNA基因在不同浮力密度中的分布規律圖。

1.4DNA-SP標記條件的優化

1.4.1離心轉速對DNA-SIP標記效果的影響

取底物投加量為30mg葡萄糖,標記時間為4天的樣品,分別在45400mpm和50300mm的轉速下于20℃離心40h,考察超高速離心轉速對標記效果的影響

1.4.2底物投加量對 DNA-SIP標記效果的影響

分別投加總量為30mg和60mg的葡萄糖,考察底物投機量對標記效果的影響。30mg葡萄糖次性投加,停止產氣時(4d)取樣。60mg葡萄糖于  第0和6天分別投加30mg,取樣時間為第11天

143若平消它每DP標定效果的響

10mn。利用上清液稀釋使得污泥固含量分別為  a1%,0.2%,0.4%,2.1%(w/w)。分批投加總量  為100mg的葡萄糖進行標記培養,即于第0,4和8  天分別投加333mg,取樣時間為第8和12天(取  樣時底物投加總量分別為660m和100mg)。樣  品經20℃,45400m,40h超離速離心分層后,考察  污泥固含量對標記效果的影響。

結果

離心條件優化

實驗室前期小試發現:經C葡萄糖標記的污泥中的CDNA與CDNA的浮力密度分別為1.70

及1.72-1.74gmL左右(數據未顯示)。因此,本研究考察了文獻報道常用的兩個離心轉速(50300mm和45400mpm)對污泥樣品的 DNA-SIP  標記效果。表1顯示:不同轉速下形成的CC介質  中相鄰梯度區帶的浮力密度差有較大差異。由表1  可知轉速為45400mpm形成的浮力密度差較小。為  確保兩種DNA離心后相隔一個區帶,能被有效分  離,故后續離心條件設為20℃,45400mpm,40h  表1不同轉速條件下微生物DNA的分離效果(gmL

2.2底物投加量優化

分別向污泥中投加總量為30mg和60mg的葡萄糖,產氣量如圖1所示。由圖可知:所有樣品的產氣量均在第1天迅速升高,微生物每消耗完30mg葡萄糖大約需4~6d,隨后逐漸停止產氣。且C

葡萄糖與C葡萄糖的產氣趨勢及產氣量基本吻合,可作為對照進行后續實驗。同時,根據產氣結果,將30mg和60mg葡萄糖標記樣品的取樣時間分別設置為第4天和第11天。

標記后的污泥樣品經超高速離心分層以后,利  用定量PCR檢測每層的16 S rDNA基因含量。獲得  16 S rDNA基因豐度在不同浮力密度中的分布規律,  如圖3和圖4所示。由圖可知,在輕密度層1.69~  1.71gmL的范圍內,所有樣品均出現最高豐度,  這表明污泥樣品CDNA在1.70gm-左右的密度  層被富集。在重密度層1.72~1.74gmL的范圍  內,投加有30mgC-葡萄糖的污泥樣品僅檢測到  較低的16 S rdNA基因拷貝數,表明該條件下C  DNA富集程度不高。投加有60mg"C-葡萄糖的樣  品CDNA豐度明顯提高,兩個平行樣品的豐度分  別達到了10.41%和6.05%,而C葡萄糖對照樣品  中的豐度僅為1.0%,這表明60mg的C-葡萄糖可  以富集到更多的CDNA,功能菌能被有效標記。  但圖3和圖4也顯示,在1.72~1.74g·mL前后的  密度層中也能檢測到一定數量的CDNA。因此,為了  為提高重密度層中CDNA的豐度,減少非目標微生

2.3污泥固含量優化

污泥固含量對 DNA-SIP標記效果的影響如圖5~  圖8所示。由圖可知:在1.72-1.74gmL的密度范  圍內,污泥固含量為0.1%,0.2%和0.4%(w/w)的所  有樣品的CDNA拷貝數明顯高于2.1%的樣品。  當底物投加量為66.6mg時(標記8天的樣  品),C-DNA主要存在于1.72gmL左右的密度層,且不同污泥固含量樣品的"CDNA豐度差異較大。污泥固含量為0.1%,0.2%,0.4%和2.1%(w/w)的樣品中,C-DNA豐度分別約為16.3%10%,10%和8.2%。這表示在該底物濃度下污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。而在更“重”的密度層1.74g·mL附近,各污泥固含量的CDNA豐度均低于5%。

當底物投加量為100mg時(標記12d的樣品),與第8天的標記樣品相比,所有污泥樣品在72-1.74g·mL密度層的CDNA豐度均有明顯提升。尤其在1.74g·mL的密度層,除污泥固含量為2.1%的樣品外,其它樣品的CDNA豐度均從第8天的低于5%提升至15%左右。上述結果

表明:當底物投加量從66.6mg增至100mg時,可  有效提高CDNA在重密度層的豐度,顯示出更好  的標記效果。此外2.1%固含量的污泥樣品中的CDNA拷貝數在1.72-1.74gmL密度層仍然最低,表明即使投加更高濃度的底物,相對較低的污泥固含量仍更有利于CDNA的富集。但在污泥固含量為0.4%,0.2%,0.1%的樣品中,CDNA在1.74gmL密度層的豐度并未隨著污泥固含量的減少而增大(分別為16.3%,14.2%和14%)。這可能是底物投加量已超過污泥中微生物的代謝水

平,大部分功能微生物已被標記,若繼續增加底物投  加量難以提高樣品的標記效果。

討論

DNA-SIH具有鑒定不同環境中“真正”功能微  物的優勢。合適的標記及離心條件可以避免底物  二級利用,確保DNA的標記及富集效果,是決定  該技術成功的關鍵。但標記效果受到多因素的影  響:如環境樣品性質、微生物種類、底物結構、標記時  間離心轉速及時間等, DNA-SIP的培養條件及離心  條件難以標準化。鑒于利用 DNA-SIP識別沼氣工程沼氣池厭氧  消化功能微生物的研究相對較少,本研究考察了不  同條件(離心轉速、底物投加量和污泥固含量)對厭  氧污泥中葡萄糖利用菌的標記效果的影響。  利用超高速密度梯度離心技術可有效地將環境  總DNA中的CDNA與CDNA有效分離。本研  究發現45400mm的轉速比50300mpm有更好的CDNA富集效果。據報道,DNA在CaC1介質中的浮力密度與微生物的GC含量成正比”。但無論哪種轉速條件,重浮力密度層仍然同時含有2CDNA與CDNA。 Lueders8等發現,即使采用純菌的CDNA進行超高速離心,重密度層中仍能檢測到0.7%的CDNA。因此,這說明目標微生物很難00%被標記, DNA-SIF實驗必須設計C底物的對照樣品。

研究表明,當 C-DNA豐度接近20%時,更容  易從環境樣品總DNA中分離出"CDNA。而C  DNA的生成伴隨著微生物細胞對底物的同化利用,  這表明CDNA豐度與底物投加量和微生物種群數  量(本文為污泥固含量)存在直接聯系。底物投加  量優化結果顯示:在1.2-1.74g·mL-的密度范

圍內,投加30mg1C-葡萄糖的污泥樣品的C.DNA

豐度較低。目前尚無標準方法來確定底物投加量

但底物濃度過低難以標記到目標微生物,因為僅有

1/3的底物被微生物用于合成自身物質。此外,加入體系的底物被微生物同化之前會有一個稀釋過

程,這使得微生物會暫時利用其他碳源或中間代謝產物,這一特性降低了C-DNA的比例,進一步增加了計算底物投加量的難度°。雖然分批投加60mgC-葡萄糖可以將C-DNA豐度提高到10.41%,但仍含有較多的非目標微生物。因此,在后續考察污泥固含量的研究中,將"C-葡萄糖投加量提高到了100mg,此時污泥中C-DNA豐度最高可達16.3%。上述結果表明,高的底物投加量有助于提高CDNA豐度。但底物投加量過高,一方面會增加DNA-SIP的成本;另一方面會使樣品脫離原始狀態群落代謝過程受到影響,產生微生物富集偏差,不符合 DNA-SIP原位鑒定的宗旨。因此,在滿足CDNA的標記效果及分離效果的基礎上,采用最少的C底物是理想的培養實驗。污泥固含量研究結果顯示:當底物濃度一定時(不高于污泥最高代謝水平),污泥固含量越低,C-DNA富集程度越高。該結果進一步證實底物量與微生物種群數量需要有合適的比例,才能獲得最高的標記CDNA。不同研究報道中的微生物菌群生態位、生理代謝差異極大,因此,非常有必要對這兩個因素進行優化

4結論

選擇合適的標記及離心條件以獲得足夠的C  DNA,是利用 DNA-SIR技術成功富集功能微生物的關鍵。本研究以C葡萄糖為底物,選取離心轉速,底物投加量和污泥固含量3個重要因素,考察了它  們對沼氣工程沼氣池厭氧消化污泥中葡萄糖利用菌的 DNA-SIP標記效果的影響。結果顯示,相對低的轉速、高底物投  加量及低污泥固含量可以獲得較高的CDNA豐  度。但底物量不能一味增加,需同時考慮微生物的  代謝水平、與環境條件的一致性等因素,在盡量減少