云南紅豆杉( Taxus yunnanensis Cheng et La)又名西南紅豆杉,是云南省級珍貴樹種,也是云南省一級重點保護樹種,是中國生產紫杉醇藥物的主要樹種-3。研究發現,云南紅豆杉根、皮、枝葉中含治癌藥物成分紫杉醇等多種治癌藥物成分,含量達0.02%。具有防治癌癥、白血病等特殊療效。但目前由交鏈孢霉屬造成的云南紅豆杉葉片葉斑病現象日趨普遍,影響了樹勢生長及藥用、觀賞價值。

紅泥膜沼氣池沼液是有機物在進行厭氧消化產生沼氣的同時  而得到的一種厭氧產物,含有豐富的營養物質,礦物  質、水解酶、B族維生素、氨基酸、植物激素、抗生素

和腐殖酸等6,是一種良好的有機液體肥料,同時又有殺滅或抑制植物病原菌的作用。

相關研究顯示,不同發酵原料產生的紅泥膜沼氣池沼液對交鏈孢菌有不同的抑制效果,其中青蒿紅泥膜沼氣池沼液的抑制效果最好7。目前對紅泥膜沼氣池沼液抑制各種病原菌方面的研究較多8-1,但對于在紅泥膜沼氣池沼液中添加活性成分對云南紅豆杉葉斑病病原菌方面的類似研究較少,但是由于在發酵紅泥膜沼氣池沼液中檢測到了腐殖酸,赤霉素,VB1,VB2,VB6及NH4等活性物質,為了探究是哪種活性物質對抑制交鏈孢菌起主導作用,并且哪種濃度的活性物質對紅泥膜沼氣池沼液抑制交鏈孢菌的效果影響最為顯

著,因此,本實驗采用青蒿原紅泥膜沼氣池沼液做空白,并在紅泥膜沼氣池沼液  中添加不同濃度的腐殖酸,赤霉素,VB1,VB2,VB6  及(NH4)2SO4,旨在能獲得增強紅泥膜沼氣池沼液抑制植物病原菌的有效方法。

1實驗材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1供試病原菌  實驗所用交鏈孢菌由云南農業大學植物病理重  點實驗室(該室分離提純并鑒定的菌株)提供。

1.1.2培養基  實驗室采用常規的PDA培養基4。采用馬鈴  薯為培養基,配方為:馬鈴薯200g(去皮切成1cm  左右的正方體小塊后煮30min,過濾取清液用),葡萄  糖25g,瓊脂20g,加水至1000mL,不調節pH值

1.1.3藥品

葡萄糖,瓊脂粉,腐殖酸,赤霉素,VB1,VB2,VB。及(NH4)2SO4

1.1.4儀器

實驗所用主要儀器為:電磁爐、燒杯、玻璃棒、紗  布、試管、培養皿、恒溫培養箱、高溫滅菌鍋、無菌打孔器、鑷子、接種環和SWCJ-1F潔凈工作臺(14-15

1.1.5供試紅泥膜沼氣池沼液  取用學校周邊青蒿( Artemisia annua)為發酵原料經過正常發酵后的紅泥膜沼氣池沼液。

.2方法

1.2.1紅泥膜沼氣池沼液的處理方法  將不同來源的紅泥膜沼氣池沼液經12000pm離心1min后  取上清液0.5mL加入已準備好的培養基表面,涂布  均勻后做實驗組,對照組則加入0.5mL無菌蒸餾水  14-15

1.2.2活性成分處理方法

(1)依次向以青蒿作為發酵原料的紅泥膜沼氣池沼液內部添加腐殖酸調節濃度依次為1%,2%,3%,4%,5%,6%。

(2)依次向以青蒿作為發酵原料的紅泥膜沼氣池沼液內部添加赤霉素,并調節其濃度為0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(3)依次向以青蒿作為發酵原料的紅泥膜沼氣池沼液內部添加VB1,并調節其濃度為0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,0.6%。

(4)依次向以青蒿作為發酵原料的紅泥膜沼氣池沼液內部添加VB2,并調節其濃度為0.1%,0.2%,0.3%

0.4%,0.5%,0.6%。  (5)依次向以青蒿作為發酵原料  加VB,并調節其濃度為0.1%0的  0.4%,0.5%,0.6%。  (6)依次向以青蒿作為發酵原料的沿  加(NH4)2SO4,調節濃度依次為1%,2%,3%  5%,6%。

1.2.3數據處理方法

抑制菌絲生長率計算采用生長速率法  抑制數(cm)=對照平板培養基上菌落直

抑菌率(%)=  處理平板培養基上菌落

對照菌落凈生長量一處理菌落凈生長盛  對照菌落凈生長量

1.2.4試驗方法

(1)將供試菌種接種于PDA平板培養基上至長滿整個平板,放置備用

(2)不同濃度活性成分的添加:分別向青液中添加腐殖酸,赤霉素,VB1,VB2,1(NH4)2SO4。濃度梯度如下:

含腐殖酸的濃度依次為1%,2%,3%5%,6%;含赤霉素的濃度依次是0.1%03%0.4%,0.5%,0.6%:含(NHL)0  依次是1%,2%,3%,4%,5%,6%;含VB、  VB的濃度依次是0.1%,0.2%,0.3%.049  0.6%。加入預先備有培養基的(q=9m)平  布均勻,2個平行,備用,對照組用無菌蒸餾水

(3)抑菌試驗:把調配好的紅泥膜沼氣池沼液和青蒿原沿液  分別采用打孔粘貼法進行抑制交鏈孢菌的實驗,取  布滿供試交鏈孢菌的PDA培養基平板,用無菌打孔  器(q=9mm)取出菌落邊緣生長旺盛的菌絲,用子小心地將菌種塊移入不同抑菌液處理的平板上菌絲一面朝上,每個培養皿中放入3小塊菌種,并呈三角形放于平板中央,加蓋并標記,放于25℃恒溫培養箱中培養,定時觀察測量不用培養基平板上交鏈孢霉菌的直徑1。

(4)待培養24h以后,用十字交叉法測量菌塊生長的大小。之后每天同一時間再對菌塊進行一次測量,一共測量4d的數據14-15。

2結果與分析

2.1不同濃度腐殖酸對紅泥膜沼氣池沼液抑菌效果的影響  向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的紅泥膜沼氣池沼液里

邊添加不同濃度的腐殖酸,復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖1所示。

由圖1可以看出,在添加的腐殖酸濃度為1%  2%時,復配液對交鏈孢菌的抑菌效果弱于青蒿原  紅泥膜沼氣池沼液,而當添加的腐殖酸濃度大于2%時,其復配液  的抑菌活性強于青蒿原紅泥膜沼氣池沼液。當添加的腐殖酸濃度  介于3%-6%時,隨著病原菌培養時間的增長,青蒿原紅泥膜沼氣池沼液與復配液之間的抑菌強度差距減小,且當病原菌生長到第4天時,抑菌率都達到了70%。由于腐殖酸對病原菌游動孢子的萌發的抑制效果隨濃  度的增加而更顯著,所以得出:高濃度的腐殖酸  對病原菌起到抑制生長的作用,低濃度的腐殖酸反而抑菌效果較差。  2.2不同濃度的赤霉素對紅泥膜沼氣池沼液抑菌效果的影響  向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的紅泥膜沼氣池沼液里  邊添加不同濃度的赤霉素,復配后對交鏈孢菌抑菌

果的對比結果如圖2所示。

由圖2可以看出,當添加的赤霉素濃度在0.1%~0.3%時,復配液對交鏈孢菌的抑制作用弱于青蒿原紅泥膜沼氣池沼液,但當添加赤霉素的濃度在0.4%

0.6%時,復配液的抑菌作用強于青蒿原紅泥膜沼氣池沼液,隨著添加赤霉素濃度的不斷加大,抑菌效果與原紅泥膜沼氣池沼液相當。因為赤霉素具有促進細胞分裂和伸長的作用,較低濃度時則表現出刺激病原菌,但濃度較高時則會使細胞死亡。所以可得:高濃度的赤霉素能加強原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果,反之低濃度的赤霉素則削弱原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果。

2.3不同濃度的VB1對紅泥膜沼氣池沼液抑菌效果的影響  向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的紅泥膜沼氣池沼液里  邊添加不同濃度的VB1,復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖3所示。

由圖3可看出,當添加的VB1的濃度為0.1%時,復配液的抑菌效果強于青蒿原紅泥膜沼氣池沼液,但是隨著添加的VB1濃度的增大,對交鏈孢菌的抑制作用逐漸減弱。VB1對細胞具有刺激生長的作用,但存在刺激生長的最適濃度0.1%,所以隨著添加濃度的不斷增大至超過最適濃度,復配液對病原菌的抑制作用不斷減弱。由此可以得出:低濃度的VB1對原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果有加強的作用,而高濃度的VB1則會削弱青蒿原紅泥膜沼氣池沼液對交鏈孢菌的抑制效果。

2.4不同濃度的VB2對紅泥膜沼氣池沼液抑菌效果的影響

向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的紅泥膜沼氣池沼液里邊添加不同濃度的VB2,復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖4所示。

由圖4可以看出,在添加VB2的濃度在0.1%  ~0.3%時,復配液的抑菌效果顯著;但當添加的  VB2大于0.3%時,隨著VB2濃度的增加,其復配液  的抑菌效果趨于平穩。因為ⅤB2對細胞生長代謝  起促進作用,但存在促進的最適濃度0.2%,所以在  添加濃度不斷增大至超過了最適濃度時,對原紅泥膜沼氣池沼液  的抑菌效果影響越來越不顯著。由以上得出:VB2

能夠有效地增加青蒿原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果。

2.5不同濃度的VB6對紅泥膜沼氣池沼液抑菌效果的影響

向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的紅泥膜沼氣池沼液里邊添加不同濃度的VB6,復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖5所示。

由圖5可以看出,當添加VB6的濃度在0.3%時,復配液對交鏈孢菌的抑制效果強于青蒿原紅泥膜沼氣池沼液;當添加的ⅤB濃度增加到0.4%時,復配液的抑制作用弱于青蒿原紅泥膜沼氣池沼液。VB。在細胞蛋白質的合成和分解代謝中起到促進作用,添加低濃度時促進作用較強,導致原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果加強,隨著添加濃度的增大,促進作用減弱導致原紅泥膜沼氣池沼液的抑制效果不顯著。由此得出:低濃度的VB6可以增強原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果,反之則降低了原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果。

2.6不同濃度的(NH4)2SO4對紅泥膜沼氣池沼液抑菌效果的影

響  向以青蒿為發酵原料經過正常發酵后的紅泥膜沼氣池沼液里邊添加不同濃度的NH4,復配后對交鏈孢菌抑菌效果的對比結果如圖6所示。  由圖6可以看出,向青蒿原紅泥膜沼氣池沼液里添加NH4對

紅泥膜沼氣池沼液抑制交鏈孢菌的生長有顯著的影響,出  對病原菌孢子的萌發起抑制作用,所以,  同濃度的NH4的復配液的抑菌效果都  紅泥膜沼氣池沼液。隨著病原菌培養時間的增加,M,F  紅泥膜沼氣池沼液抑制交鏈孢菌的影響逐漸減弱,但始終  增強原紅泥膜沼氣池沼液抑菌的效果。

綜上可知,在紅泥膜沼氣池沼液里添加不同濃度的腐隨  霉素,VB1,VB2,VB6及(NH4)2SO4都對青德原  抑制交鏈孢菌有不同程度的影響。各活性成適濃度依次是:3%,0.4%,0.1%,0.4%,01%。但是低濃度的vB。對原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果影響,高濃度的VB6反而削弱了原紅泥膜沼氣池沼液的抑用?？偟膩碚f,青蒿紅泥膜沼氣池沼液中添加合適濃度的活分對抑制交鏈孢菌具有較好的效果。

3結論

當紅泥膜沼氣池沼液中添加的腐殖酸濃度為1%-2%時  復配液對交鏈孢菌的抑制效果弱于青嵩原紅泥膜沼氣池沼液  添加腐殖酸的濃度介于3%~6%時,復配液對  孢菌的抑制作用強于青蒿原紅泥膜沼氣池沼液,并且隨著病原  培養時間的增強,青蒿原紅泥膜沼氣池沼液與復配液之間的  效果相當,因此,紅泥膜沼氣池沼液添加腐殖酸的最適濃度為3%。

當紅泥膜沼氣池沼液中添加的赤霉素濃度為0.1%-03時,其復配液對交鏈孢菌的抑制效果弱于青蒿原液,但是,添加赤霉素濃度介于0.4%~0.6%時,復配液對交鏈孢菌的抑制作用強于青蒿原紅泥膜沼氣池沼液,但著添加的赤霉素濃度的不斷增加,青蒿紅泥膜沼氣池沼液與復液之間的抑菌效果相當,因此,紅泥膜沼氣池沼液添加赤霉素的量佳濃度為4%。  當紅泥膜沼氣池沼液中添加的VB1濃度為0.1%時,其復

液對交鏈孢菌的抑制效果強于青蒿原沿液,但隨著41  添加的VB1濃度的增加,復配液的抑菌效果有所減  弱,因此,紅泥膜沼氣池沼液添加VB1的最適濃度為0.%。  當紅泥膜沼氣池沼液中添加的VB2濃度為0.1%-0.3%時,  其復配液對交鏈孢菌的抑制效果隨著添加的(3  的濃度的增加而增強,但添加的VB2的濃度為  0.3%-0.6%時,其復配液的抑菌效果與青蒿原沼(6  液的幾乎相同,因此,紅泥膜沼氣池沼液里添加VB2的最適濃度  為0.3%。  當紅泥膜沼氣池沼液中添加的VB濃度小于0.3%時,其復  配液對交鏈孢菌的抑制效果幾乎與青蒿原紅泥膜沼氣池沼液相(8  當但添加VB6的濃度大于0.4%時,其復配液的抑  菌效果又低于原紅泥膜沼氣池沼液,因此,低濃度的VB6對青蒿  原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果幾乎無影響,但高濃度的VB反而會削弱原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果。

當青蒿紅泥膜沼氣池沼液中添加不同濃度的NH,其復配液對交鏈孢菌的抑制效果都比青蒿原紅泥膜沼氣池沼液要強,但是隨著病原菌培養時間的增長,其NH對青蒿原沼  液的影響逐漸減弱,但始終增強了青蒿原紅泥膜沼氣池沼液的抑菌效果。  有相關研究表明:豬糞紅泥膜沼氣池沼液中的NH4對辣椒  疫霉菌的抑制效果,其結果表明NH4不僅可抑制  疫霉屬病原真菌游動孢子的釋放,還可抑制其萌發,  進而降低土壤中病原菌的數量,且腐殖酸是畜禽糞  便紅泥膜沼氣池沼液中有機碳的主要成分,不僅可以作為調節劑  改善土壤結構,提高土壤肥力,還可以作為生物催化  劑和生物刺激劑促進植物生長,提高植物抵御病、蟲  害能力。另外也有研究表的(1,腐殖酸能刺激土壤  中有益微生物的生長和繁殖。所以,在紅泥膜沼氣池沼液里添加  適宜濃度的活性成分對病原菌的抑制效果有有效影

摘自《中國沼氣》第4期 劉繼紅 尹芳 王昌梅 趙興玲  吳凱 柳靜 楊紅 劉士清 張無敵

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